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使用 GC/FID 对天然脂质进行脂肪酸分析

天然脂质包含连接到鞘氨醇部分的脂肪酸的异质混合物。脂肪酸组成取决于多种因素,包括物种、生物体内的位置、年龄和环境条件。脂肪酸的正常变化包括链长、羟基化和不饱和度。

为了确定脂质样品中存在的脂肪酸成分,将脂肪酸转化为脂肪酸甲酯。然后可以通过 GC/FID 对其进行分析,并通过将保留时间与参考标准进行比较来识别单个脂肪酸甲酯。


从甘油酯和磷脂制备甲酯:甲醇碱水解

  1. 称取 5 mg 待测干样品放入反应容器中。

  2. 向样品中加入 1ml 己烷。

  3. 加入 50 μl 1M 甲醇钠的甲醇溶液。

  4. 充分混合。

  5. 在室温下静置 5 分钟。

  6. 样品现在可以通过 GC/FID 进行分析。


从磷脂、中性鞘脂、中性鞘糖脂和酸性鞘糖脂制备甲酯:甲醇硫酸

  1. 配制 2% 硫酸的甲醇溶液。  使用前必须新鲜配制 2% 硫酸/甲醇溶液。

  2. 将 1 ml 硫酸溶液加入 15 ml 反应管中的 5-10 mg 干脂质样品中。

  3. 向反应混合物中加入 1 个沸腾器。

  4. 用氩气覆盖并用特氟龙内衬盖密封。

  5. 放置在平衡的加热块中,如下所示:

    1. 脂肪酸到甲酯 – 5 分钟 @ 80°C

    2. 2- 或 3- 羟基脂肪酸 – 1.5 小时。 @ 80°C

    3. 磷脂 – 2 小时。 @ 70°C

    4. 糖脂 – 6 小时。 @ 100°C

    5. 鞘磷脂 - 2 小时。 @ 100°C

  6. 在所需时间结束时,从加热块中取出并冷却至室温。  不要打开直到冷却!

  7. 添加 0.5 ml 去离子水,这将停止反应。

  8. 加入 4 ml 己烷并剧烈摇晃。

  9. 让设置直到两个阶段是可见的。  注意:顶部己烷层必须是透明的。

  10. 去除顶部的己烷层并保存。

  11. 再重复步骤 7-9 两次。

  12. 完全提取后丢弃底层。

  13. 合并三个顶层并加入少量硫酸钠/碳酸氢钠 (4:1) 的混合物。

  14. 用力摇晃。

  15. 使用移液器将溶剂层转移到 15mL 反应管中。  注意:小心不要拉出任何硫酸钠/碳酸氢钠固体。

  16. 用氮气流浓缩至 1 ml。

  17. 样品现在可以通过 GC/FID 进行分析。


  18. 脂肪酸甲酯的 GC/FID 分析

    气相色谱条件:*
    1. 色谱柱: SP-2330 或 RTX-2330; 30 x 0.25mm x 0.2μm

    2. 烤箱: 200°C 等温

    3. 载流子线速度: 速度 氦气, 为 20 厘米/秒。

    4. 检测器: FID,250°C

    5. 喷油器: 250°C

    6. 分割比: 100:1

    7. *这些是脂肪酸甲酯的通用 GC 条件,可能无法分离样品的所有成分。


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